客户文章 | 细菌来源的吲哚-3-乳酸影响巨噬细胞调控肠道免疫稳态
黏膜组织是微生物和人体最重要的相互作用界面。肠道黏膜组织聚集了人体 70%以上的微生物群和免疫细胞。越来越多的证据表明微生物及其相关代谢物对于调节肠道免疫稳态具有极为重要的作用，影响稳态的微生物和效应物质的鉴定与机制解析是国际上的前沿研究领域。
炎症性肠病(IBD) 是一类与免疫稳态失调密切相关的肠道炎性疾病，在我国发病率呈上升趋势。IBD发病机制复杂，与环境、宿主遗传易感性、肠道菌群紊乱，免疫应答异常等多种因素有关。IBD的治疗长期以来是临床上面临的巨大挑战。调节肠道免疫稳态的共生菌群及代谢物质的研究有望为IBD治疗提供新思路。
近日，天津医科大学王荃教授课题组在PNAS发表文章，题目为“Bacterial indole-3-lactic acid affects epithelium-macrophage crosstalk to regulate intestinal homeostasis”。
该研究在人源肠道菌群中筛选获得一株兼性厌氧细菌-大肠杆菌 Ec-TMU，发现该菌株能够产生丰富的色氨酸代谢物，其中吲哚-3-乳酸(ILA) 具有显著的调节肠道稳态效应。机制方面，发现 ILA 通过 AHR 下调糖酵解、NF-κB 和 HIF 信号通路，抑制炎症环境中的上皮细胞产生 CCL2/7，减少炎型巨噬细胞在结肠组织的累积。临床数据显示，粪便 ILA 水平与 IBD 进展显著负相关。该研究提出了肠道共生细菌调节肠道免疫稳态的新机制，为 IBD 的治疗提供了潜在策略。
替硝唑治疗的患者肠道微生物群可以预防小鼠DSS诱导的结肠炎
图1 一些接受替硝唑治疗的患者的粪便可以保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎。
(A) DSS诱导急性结肠炎结合粪便移植的小鼠模型示意图。小鼠在氨苄西林、万古霉素、新霉素和甲硝唑混合物 (AVMN) 联合处理6d和水处理2d后，然后每天灌胃来自接受替硝唑治疗患者或健康人的粪便，连续14d。粪便移植7d后，小鼠同时服用3.5%DSS，诱发结肠炎7d，小鼠被杀死。
小鼠分为3组：对照组（移植健康人粪便）、TNZ-L组和 TNZ-S组。(其中移植替硝唑治疗患者粪便的小鼠分两组：可以改善DSS诱导的结肠炎组(TNZ-L) 和与移植健康人粪便效果相似组(TNZ-S))。对照组、TNZ-L组和TNZ-S组的DSS给药后结肠长度 (B) 、体重 (C) 、疾病活动指数 (D) 和组织病理学评分 (E) 进行分析。
替硝唑治疗的患者和健康人的粪便收集细菌DNA用于16S rRNA测序。(F) 对照组、TNZ-L组和TNZ-S组的细菌α多样性分析。(G) 对照组、TNZ-L组和TNZ-S组的细菌β多样性分析。(H) 对照组、TNZ-L组和TNZ-S组的细菌属水平的平均相对丰度。(I) 对照组、TNZ-L组和TNZ-S组中的专性厌氧细菌和兼性厌氧细菌的百分比。(J) 对照组、TNZ-L组和TNZ-S组在细菌属水平的平均相对丰度的热图，红色标记的是厌氧细菌。(K) TNZ-L组A中含量高于其他两组的属。(L) 维恩图显示，用替硝唑治疗的人和用甲硝唑治疗的小鼠的粪便样本中富含兼性厌氧细菌属。
小鼠重复数量。每组 n= 5或4。
大肠杆菌Ec-TMU缓解小鼠DSS诱导的结肠炎
图2 Ec-TMU保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎。从TNZ-L组粪便中分离出的菌株中筛选出大肠杆菌EC-TMU。
(A) 检测单一细菌对结肠炎的预防作用的小鼠模型的示意图。在5d的AVMN和1d的水处理后，小鼠每天灌胃109个CFU的K. singaporensis、Ec-TMU、K12或无菌水。在单一菌株预处理5d后，小鼠同时给予3.5%DSS和LPS(8mg/kg体重) 以诱导结肠炎，此外，单一菌株再给药7d。分析每组的体重(B) 、疾病活动指数(C) 、结肠长度(D) 和组织病理学评分(E) 。
(F) 用于检测单一细菌对结肠炎的治疗效果的小鼠模型的示意图。在5d的AVMN和1d的水处理后，每天给小鼠灌胃109CFU的K. singaporensis、Ec-TMU或无菌水。然后，同时给予小鼠3.5%DSS和LPS(8mg/kg体重) 来诱导结肠炎，此外，还给予单一菌株治疗7d。分析每组的体重(G) 、疾病活动指数(H) 、结肠长度(I) 和组织病理学分数(J) 。
(K) 在无菌小鼠中，检测单一细菌对DSS诱导结肠炎的治疗效果的模型示意图。每天用109 CFU的单一菌株或水以及2.5%DSS对小鼠进行灌胃，暴露8d，然后小鼠被处死。分析每组的疾病活动指数(L) 、结肠长度(M) 和组织病理学评分(N) 。(O) 无菌小鼠结肠中炎性细胞因子的mRNA表达水平。
小鼠重复数量。(B-E) 每组n = 9。(G-J和L-N) 每组n = 6。(O) n = 每组4。NS, 没有显著差异。
大肠杆菌Ec-TMU抑制DSS诱导的结肠炎期间促炎巨噬细胞的积累
图3 Ec-TMU降低结肠固有层(cLP)中的炎症巨噬细胞。探索了在DSS诱导的结肠炎中受Ec-TMU影响的肠道微环境中的免疫细胞。小鼠的结肠固有层(cLP)分别从Ec-TMU、K12或对照组小鼠收集(图2.A 模型) ，采用流式细胞术分析淋巴细胞。
(A) cLP中的巨噬细胞数量和非嗜酸性细胞中巨噬细胞的百分比。(B) cLP中CX3CR1+巨噬细胞的数量和在总巨噬细胞中的百分比。(C) cLP中P1-P4亚群的数量和P1-P4亚群在总巨噬细胞中的百分比。
大肠杆菌Ec-TMU代谢物调节结肠上皮细胞中的CCL2和CCL7表达
图4 Ec-TMU上清液可降低上皮细胞中CCL2/7的表达。第7d，图2.A 模型的小鼠被处死。Ec-TMU上清液进一步划分为六种分子量级别(≥100/50/30/10/3和<3 kDa)，结果发现<3 kDa级别显著抑制CCL2和CCL7的表达。
(A) 结肠中Ccl2和Ccl7的mRNA表达水平。(B) 小鼠结肠中CCL2表达的免疫荧光分析。蓝色，细胞核；绿色，上皮细胞粘附分子(Epcam) ；红色，CCL2。(C) 小鼠结肠中CCL7表达的免疫组化分析。
结肠固有层(cLP)中的淋巴细胞分析。(D) cLP中CCR2+巨噬细胞的数量和百分比。(E) cLP中CCR5+巨噬细胞的数量和百分比。
(F和G) SW480细胞用细菌培养上清液和LPS(10 μg/mL) 刺激3h。(F) Ccl2的mRNA表达水平和(G) Ccl7的mRNA表达水平
(H-J) SW480细胞同时用细菌培养上清液(750 μL, <3 kDa) 和LPS(10 μg/mL) 刺激3h。(H) Ccl2和Ccl7的mRNA表达水平。(I和J) 细胞中CCL2和CCL7的免疫荧光分析。
大肠杆菌Ec-TMU衍生的吲哚-3-乳酸(ILA)对DSS诱导的结肠炎有治疗作用
图 5 来自Ec-TMU的吲哚-3-乳酸(ILA) 可以保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎。采用LC-MS法分析Ec-TMU上清液的<3 kDa部分。
(A-D) 与BHI或K12培养上清液相比，Ec-TMU培养上清的代谢物(<3 kDa) 的折叠变化和p值分布((A和B) )、上调代谢途径的KEGG分析(C和D) 。
(E) SW480细胞分别用PBS、LPS(6 μg/mL) 加 DMSO / 100 μM / 200 μM ILA刺激6h，评估Ccl2和Ccl7的mRNA表达水平。
(F) 在BHI, Ec-TMU, Klebsiella singaporensis 和K12 培养上清液中(<3 kDa) 的吲哚-3-乳酸(ILA)水平分析。
(G和H) 用LPS(6 μg/mL) 加ILA(200 μM ) 或 DMSO 培养的细胞，刺激6h后，细胞中CCL2和CCL7的免疫荧光分析。CCL2或CCL7：绿色；DAPI：蓝色。
(I) 结合ILA治疗的DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型的示意图。在3.5% DSS给药2d后，小鼠每天被灌胃无菌水或40 mg/kg的吲哚-3-乳酸(ILA)。分析各组的体重(J) 、疾病活动指数(K) 、结肠长度(L) 和组织病理学分数(M) 。结肠中炎症细胞因子的mRNA表达水平(N)。
(O-R) 在第7天，收集小鼠的结肠固有层(cLP)，使用流式细胞仪分析淋巴细胞；对结肠组织进行染色和分析。(O) cLP中炎症(P1/P2) 亚群的数量和百分比。(P) cLP中CCR2+ P1/P2巨噬细胞的数量和百分比。(Q) 小鼠结肠中CCL7表达的免疫组化分析。(R) 小鼠结肠中CCL2的免疫荧光分析。蓝色，细胞核；绿色，Epcam；红色，CCL2。
吲哚-3-乳酸ILA通过调节HIF、NF-κB信号通路和糖酵解来抑制炎症期间的CCL2和CCL7表达
图 6 吲哚-3-乳酸(ILA) 通过下调HIF、NF-κB通路和糖酵解来降低上皮细胞中的CCL2和CCL7表达。研究ILA影响CCL2/7表达的潜在分子机制，进行RNA-seq分析。
(A-E) 用PBS或LPS(6 μg/mL) 加DMSO / ILA(200 μM) 处理6h的SW480细胞。(A) 火山图显示SW480细胞中上调和下调的基因。(B) 细胞的KEGG分析。糖酵解(C) 、NF-κB(D) 、HIF(E) 信号通路的基因表达热图。
(F-H) 在第7天(在图5.I的模型中) ，收集结肠组织进行染色和分析。(F) 分离的结肠细胞的乳酸含量。结肠组织中HIF1α(G) 和p-IκBα(H) 表达的免疫组化分析。(I-K) SW480细胞用DMSO、NF-κB激动剂 [Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) ,100 nM] 预处理4h (I)，随后用DMSO或ILA(400μM) 刺激细胞另外12h。16h后，用6 μg/mL LPS刺激6h。
SW480细胞分别用DMSO、糖酵解激动剂 (寡霉素，5 nM)(J) 、HIF激动剂(ML-228，10 nM)(K) 预处理3h，随后用DMSO或ILA(400μM) 刺激细胞另外6h。9h后，用2 μg/mL LPS刺激细胞3h。分别评估SW480细胞中的Ccl2和Ccl7的mRNA表达水平。(L-O) SW480细胞用DMSO、NF-κB抑制剂(BAY 11-7085，1μM)(L) 、糖酵解抑制剂(DCA，10 mM)(M) 、HIF抑制剂(PX-478，1μM)(N) 或AHR抑制剂(CH-223191，10μM)(O) 预处理4h，随后用DMSO或ILA(400μM) 刺激细胞另外12h。16h后，用6 μg/mL LPS刺激细胞，持续6h。评估了SW480细胞中的Ccl2和Ccl7的mRNA水平。
(P) 处理过程与图6.O相同。SW480细胞中的HIF1α、p-IκBα和IκBα的密度被标准化为β-肌动蛋白的密度。DMSO组的相对密度设置为100%。
(Q) 处理过程与图6.O相同。ILA和CH-223191对SW480细胞糖酵解的影响的胞外酸化率(ECAR) 分析。在用葡萄糖(10 mM) 、寡霉素(2 µM) 和2-DG(50 mM) 进行顺序处理后，测量ECAR水平，以计算糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。
(R) SW480细胞用DMSO或NF-κB抑制剂(BAY 11-7085，5μM) 预处理4h，随后用DMSO或ILA(400μM) 刺激细胞另外12h。16h后，用6 μg/mL LPS刺激细胞，持续6h。评估Hk1、Hk2、Eno2、Ldha和Pkm1的mRNA水平。(S) ILA和PX-478对SW480细胞糖酵解的影响的ECAR分析。在用葡萄糖(10 mM) 、寡霉素(2 µM) 和2-DG(50 mM) 进行顺序处理后，测量ECAR水平，用于计算糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。
CCL2/7- CCR2轴和吲哚-3-乳酸(ILA)含量与炎症性肠病(IBD)进展相关
图7 CCL2/7-CCR2轴和ILA含量与IBD进展相关。为了验证ILA的作用，临床检查了12例溃疡性结肠炎(UC)患者的粪便中ILA水平，和利用UC患者结肠活检组织进行单细胞转录组分析scRNA-seq。(A) 溃疡性结肠炎(UC) 患者粪便或血液中ILA水平和钙卫蛋白或C反应蛋白(CRP) 的Pearson’s 相关性分析。(B) UC患者血液或大便中的CRP、ILA和钙卫蛋白水平。(C) 来自公开数据库的具有宏基因组测序数据的IBD队列，分析双歧杆菌的芳香乳酸脱氢酶基因aldh丰度。HMP队列[n = 550(健康人) ，140(非IBD) ，222(UC) ]，Cardiff队列(n = 20) 和PRISM/STINKI队列[n = 74(对照组) 或188(IBD) ]。
(D和E) UC患者结肠组织中CCL2/7和CCR2的scRNA-seq分析。(D) UC患者和健康人的结肠活检的上皮细胞中的CCL2/7表达。(E) UC患者和健康人的结肠活检的巨噬细胞中的CCR2表达。(F) 说明ILA在肠道稳态中机制的模型图。
参考文献：
Yu K, Li Q, Sun X, Peng X, Tang Q, Chu H, Zhou L, Wang B, Zhou Z, Deng X, Yang J, Lv J, Liu R, Miao C, Zhao W, Yao Z, Wang Q. Bacterial indole-3-lactic acid affects epithelium-macrophage crosstalk to regulate intestinal homeostasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Nov 7;120(45):e2309032120. doi: 10.1073/pnas.2309032120.